Svandammen
La laguna Svandammen, en Upsala, Suecia. De aquí fue aislada la enzima a la que decidieron llamar Svi3-3. (Niko Lipsanen)
5 min. de lectura

 

Desde octubre de 2017 colaboro en la Universidad de Upsala, Suecia, con un equipo de investigación que busca encontrar nuevas proteínas en la naturaleza.

Dentro del equipo, mi tarea consiste en caracterizar cinéticamente a una enzima que hidroliza una molécula llamada S-adenosil metionina (SAM).

Esta enzima, que pertenece a un fago (virus que infecta bacterias), ha sido aislada de una laguna habitada por patos en el centro de Upsala:

El equipo de investigación ha encontrado esta proteína gracias a la colaboración de dos grupos. Llamémoslos “grupo A” y “grupo B”. Ambos buscan encontrar nuevos genes y nuevas proteínas mediante el uso de diferentes métodos. El grupo A cuenta con las herramientas para identificar nuevos genes y el grupo B cuenta con las herramientas para estudiar a las proteínas codificadas por esos genes.

Lo que hizo el grupo A fue tomar muestras de ADN de fagos de la laguna y generó una gran biblioteca con distintos fragmentos de ADN. Estos fragmentos fueron introducidos en cepas bacterianas que carecían de alguna proteína esencial para la supervivencia (cepas auxótrofas). Cuando estos fragmentos fueron introducidos, algunas bacterias murieron y otras lograron sobrevivir.

Las cepas que lograron sobrevivir lo hicieron porque el fragmento de ADN introducido las ayudó, de alguna manera, a resolver el déficit proteínico y así poder vivir. Una de las cepas bacterianas evaluadas era incapaz de producir un aminoácido llamado isoleucina. Cuando esta cepa recibió el fragmento de ADN logró sobrevivir porque este fragmento contenía la información (gen) que codifica a una proteína, la cual una vez presente en la bacteria activa otros caminos alternativos para la producción de isoleucina.

Gracias a otros experimentos, el grupo A logró identificar la función de esta proteína, la cual es hidrolizar S-adenosil metionina. Una vez aislado el gen, el grupo B se encargó de producir la proteína y determinar su estructura.

Los resultados indican que esta proteína está formada por 3 unidades, es decir, es una proteína trimérica. Cada unidad o monómero tiene una masa molecular de 16,2 kDa. Su secuencia de aminoácidos no es similar a ninguna proteína conocida hasta el momento. Por lo tanto, es una proteína nueva, de función conocida, pero de secuencia hasta ahora única.

La única SAM hidrolasa descrita hasta el momento proviene del fago T3 (Studier & Movva 1976, Hughes et al. 1987).

Ciencia básica

En términos sencillos, mi tarea es determinar en qué condiciones esta enzima funciona mejor. Si sé que esta enzima hidroliza SAM, me interesa saber, por ejemplo: ¿A qué pH funciona mejor? ¿Cuál es su eficiencia? ¿Cuántas moléculas de SAM es capaz de hidrolizar por unidad de tiempo? ¿Qué tan veloz es?

Por lo tanto, con este tipo de preguntas lo que hago es nadar en ciencia básica. Quiero caracterizar una enzima. Si comparo a esta enzima con un objeto cotidiano, por ejemplo, una computadora portátil, lo que intentaría conocer antes de comprar la computadora es: ¿Cómo se enciende? ¿Cuánto tarda en prenderse? ¿Qué tan rápido funciona?; ¿Cuánto dura su batería? ¿Podría trabajar con la computadora durante el verano paraguayo sin acondicionador de aire? ¿Es la computadora más rápida o más lenta a altas temperaturas?

Luego de responder estas preguntas, sabría cómo y en qué condiciones usar mi nueva computadora.

Si bien por el momento solo deseo caracterizar a esta enzima, gracias a esto en el futuro podría utilizarla con algún propósito. Una aplicación de la SAM hidrolasa del fago T3 ha sido su uso en tomates transgénicos con el objetivo de reducir la síntesis de etileno (Good et al. 1994) y así retrasar la maduración del fruto y prolongar su firmeza.

Desafíos en el laboratorio

En la vida cotidiana estamos acostumbrados a los procesos rápidos. Sin embargo, contestar preguntas de ciencia básica puede llevar años. Por ejemplo, el grupo A, mencionado anteriormente, ha trabajado en este proyecto desde 2014.

Para cumplir con mi tarea los pasos son:

  1. Expresar la proteína

La expresión (y purificación) de esta proteína requiere una semana de trabajo. En particular, uno de los desafíos para mí ha sido acostumbrarme a las escalas con que trabajan aquí en Suecia. En Paraguay estaba acostumbrada a cultivar bacterias en medios de cultivo líquido de aproximadamente 100 ml. Aquí trabajan con volúmenes a partir de 2 l. Eso significa que los materiales de laboratorio son de mayor volumen y, a veces, más caros.

En Paraguay trabajaba con una centrífuga refrigerada con capacidad para tubos de 50 ml. Aquí cuentan con centrífugas con capacidad para recipientes de hasta 800 ml. Levantar la tapa de esta centrífuga o cambiar el rotor de otras implica no solo logística sino trabajo físico también.

  1. Purificación de la proteína

La purificación de la proteína consiste en separarla del resto de las proteínas producidas por la bacteria, en este caso, Escherichia coli. Para poder separarla del resto de las proteínas, uno de los métodos consiste en marcar mi proteína de interés con un marcador. Es como colocar un gancho a mi proteína.

En este caso, el gancho que le pusieron a esta SAM hidrolasa es un gancho compuesto por histidinas. Estas histidinas se enganchan y quedan retenidas por un colador que tiene níquel. Estas histidinas tienen mucha afinidad por estos átomos de níquel. Como el resto de las proteínas no están marcadas, éstas pasan a través del colador y luego retiro mi proteína del colador aplicando una molécula cuya afinidad por el níquel es aún más fuerte que la de las histidinas.

Este proceso, que en realidad es súper sencillo, desde la rotura las células bacterianas hasta finalizar el proceso con el colador, toma 8 a 9 horas de trabajo.

Durante este paso, por mínimas fluctuaciones en temperatura o pH la proteína puede precipitar (pegotearse unas con otras) y tras 9 horas de trabajo tienes que empezar todo de nuevo, porque la proteína en esa condición es inservible.

  1. Verificación de pureza

Un paso previo al uso de la proteína consiste en verificar la pureza de mi proteína. Para eso coloco un poco de material extraído durante diferentes pasos de la purificación en un gel. Este gel está hecho de un polímero y separa mi muestra de acuerdo al tamaño de los componentes que están presentes en la misma.

Supongamos que el gel es una red que tiene agujeros de un tamaño dado, a través de los cuales pasan solamente las proteínas que tengan el tamaño adecuado para atravesar ese agujero. Si yo sé el tamaño de mi proteína, sabré qué red utilizar y sabré en qué parte del gel iría a parar mi proteína de interés.

En Paraguay este tipo de geles los tenía que preparar mezclando ingredientes, como si me pusiera a preparar una gelatina. Mezclaba los ingredientes y mi gel estaba listo, digamos que en una hora.

Colocar las muestras en el gel, separar las proteínas, luego teñir el gel (las proteínas no se ven a simple vista, hay que pintarlas con un colorante) y desteñirlo posteriormente tomaba aproximadamente 4 días.

Los laboratorios que pueden compran los geles de las empresas que los producen. Increíble es la sensación cuando puedes acceder a un gel ya hecho (una gelatina ya hecha), colocar las muestras, separar las proteínas, teñir y desteñir el gel en poco menos de 90 minutos.

Para mí ha sido sencillamente imposible describir la sensación que me causa poder hacer en una hora y media un proceso que me tomaba 4 días en Paraguay.

  1. Uso de la proteína

Finalmente, lo que quiero hacer es estudiar a esta proteína. Sé que esta enzima cataliza una reacción química donde la molécula SAM se disocia (se rompe) gracias a la presencia del agua en los productos llamados Homoserina (Hse) y Metiltioadenosina (MTA).

Figura 1: Uso de SAM en una reacción química llamada metilación (arriba). Hidrólisis de SAM por la enzima SAM hidrolasa (abajo).

Para poder determinar cualquier característica cinética de esta enzima necesito poder medir su o sus productos de alguna manera. Recordemos que estos productos no veo a simple vista, así que debo encontrar un mecanismo que me permita detectar y cuantificar la cantidad de producto formado.

En este caso se han ideado dos métodos para detectar estos productos:

Primer método: separar los productos Hse y MTA de SAM mediante un colador que distingue carga eléctrica. Si el colador está cargado negativamente, SAM quedará retenido y Hse y MTA se colarán. Posteriormente puedo detectar MTA porque esta molécula absorbe radiación de la región ultravioleta del espectro electromagnético, específicamente a 260 nm.

Segundo método: seguir la reacción de la SAM hidrolasa en tiempo real mediante el acople de su reacción con otra reacción que genera una molécula llamada NADPH, la cual absorbe luz a 340 nm.

El conjunto de reacciones sería la siguiente:

Donde HSD corresponde a Homoserine dehydrogenase, NADP+ corresponde a Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidado y NADPH a la misma molécula, pero reducida.

Ambos métodos tienen sus ventajas y desventajas. Hasta el momento, he invertido casi dos meses con un método de reacciones acopladas no descrito aquí. También he invertido alrededor de 1,5 meses en el segundo método descrito aquí, el cual hasta ahora no ha dado buenos resultados. Y quedan unas cuantas semanas para probar el primer método.

Puedo decir que luego de haber invertido tanto esfuerzo en una sola proteína, miro a esos patos de la laguna Svandammen de manera diferente. Me hacen pensar: ¡Si tan sólo supieran de la enorme diversidad genética en la que nadan!

 

Referencias

  • Good X, Kellogg JA, Wagoner W, Langhoff D, Matsumura W, Bestwick RK. 1994. Reduced ethylene synthesis by transgenic tomatoes expressing S-adenosylmethionine hydrolase. Plant Molecular Biology 26: 781–790.
  • Hughes JA, Brown LR, Ferro AJ. 1987. Expression of the cloned coliphage T3 S-adenosylmethionine hydrolase gene inhibits DNA methylation and polyamine biosynthesis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology 169: 3625–3632.
  • Studier FW, Movva NR. 1976. SAMase gene of bacteriophage T3 is responsible for overcoming host restriction. Journal of virology 19: 136–145.

 

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