Modelo 3D de SARS-CoV-2 creado en el Laboratorio de Biología Molecular del MRC del Reino Unido. (MRC bajo licencia CC-BY-NC-ND 4.0)
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Participar en el desarrollo de vacunas contra la influenza y también escudriñar al SARS-CoV-2 no son tareas sencillas. Trabajar en el análisis de estructuras cristalográficas de proteínas y en genética reversa precisa mucho estudio y dedicación. Pero es la experiencia de un investigador de Paraguay.

El Dr. Alberto Amarilla, biólogo de formación, ha trabajado en el área científica desde muy joven. Oriundo de la ciudad de Benjamín Aceval, departamento de Presidente Hayes (Chaco), se trasladó a Asunción para estudiar biología en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Nacional de Asunción (UNA). Y, de esta forma, comenzar su formación en ciencias.

Actualmente vive en la ciudad de Brisbane, Australia, e integra el laboratorio de virología molecular de la Universidad de Queensland, donde trabaja en el desarrollo de potenciales vacunas para enfermedades como dengue, zika, influenza entre otras.

El año pasado, el equipo que integra en Australia presentó una potencial vacuna contra el SARS-CoV-2 que protege contra la COVID- 19. Sin embargo, debido al surgimiento de algunos contratiempos, el desarrollo en la fase clínica 2 tuvo que suspenderse. Algunas de sus publicaciones y trabajos pueden ser leídos en este link.

Amarilla es un científico que soportó la crisis de recortes a la ciencia en el Brasil pero también consiguió nuevas oportunidades en Australia, incluyendo estudios en un laboratorio de ARN.

También realizó ensayos de neutralización contra el SARS-CoV-2 y sigue desarrollando innovaciones en sus campos. En este diálogo con Ciencia del Sur profundizamos detalles de sus investigaciones y el contexto de las mismas. Además de relatar y explicar las fases de la fabricación de una vacuna contra la COVID-19.

-¿Dónde hiciste tu posgraduación y con qué trabajaste?

Al terminar la carrera universitaria me torné funcionario público del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud (IICS) de la Universidad Nacional de Asunción. Allí fui docente investigador en el departamento de Biología Molecular, a cargo de la Dra. Graciela Russomando.

En el IICS trabajé bajo la supervisión directa del Dr. Gabriel Parra. Soy infinitamente agradecido a la Dra. Russomando y al Dr. Parra por haber contribuido significativamente con mi formación científica.

Durante mi estadía en el IICS surgió la oportunidad de hacer una maestría con un paraguayo llamado Víctor Hugo Aquino Quintana, quien también se inició científicamente en el departamento de Biología Molecular del IICS-UNA. El Dr. Víctor es un prominente profesor de la cátedra de Virología de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Sao Paulo en Ribeirão Preto, Brasil.

Al ser aprobado al programa de posgraduación de inmunología básica y aplicada de la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto de la Universidad de São Paulo, me mudé al Brasil para hacer mi maestría y luego mi doctorado en el mismo programa. Allí trabajé con genética reversa aplicada a varios flavivirus tales como el dengue, así como también para estudiar la enfermedad causada por estos flavivirus.

Durante mi jornada en el laboratorio del Dr. Víctor, aprendí mucho sobre virología e inmunología y estoy infinitamente agradecido por todas sus enseñanzas y amistad.

-¿Cómo fuiste a trabajar a Australia? ¿En qué departamento estás trabajando ahí?

Primeramente, conseguí financiamiento para realizar un posdoctorado en la misma universidad (Brasil) por 4 años. En aquel entonces viajé a Australia por un año mediante una beca, para realizar una parte de mi proyecto de posdoctorado que estaba desarrollando en Brasil.

Luego de un año de trabajo intenso y muchos resultados obtenidos y publicados, volví al Brasil. En aquel momento, Brasil comenzaba a atravesar por una crisis muy fuerte con cortes sustanciales para la investigación científica en donde estuve sin salario durante más de 7 meses.

Alberto Amarilla Ortiz hizo su maestría y doctorado en inmunología básica y aplicada. Fue en la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto de la Universidad de São Paulo. (Gentileza)

Durante ese periodo, gracias a que tenía un dinero ahorrado y el soporte financiero del Dr. Víctor y el Dr. Tadeu Morães Figueiredo me dediqué enteramente a terminar todos los proyectos que quedaron pendientes.

Posteriormente, ya a finales del año 2016, recibí una oferta de trabajo de un profesor de Australia y acepté inmediatamente. Junto con mi familia volvimos a Australia en marzo del 2017.

Me integré al laboratorio de ARN (RNA en inglés) y virología molecular bajo el liderazgo del Prof. Dr. Alexander Khromykh, un profesor muy prominente en virología que tuvo importantes descubrimientos en esta área como, por ejemplo, el descubrimiento de los famosos sfRNA (del inglés sub-genomic flavivirus RNA).

Los sfRNA son una parte importante del RNA viral de los flavivirus y son los que se encargan de regular muchas funciones celulares y de esta manera el virus puede controlar la maquinaria celular, principalmente envuelta a la respuesta inmune innata de la célula.

Es un descubrimiento tan importante, que creo que con esto el profesor puede ser un candidato en el futuro al premio Nobel.

Trabajé con el profesor Alex durante 2 años y luego por asuntos de financiamiento me mudé al laboratorio donde actualmente estoy, el laboratorio de Virología Molecular con el proyecto Molecular Clamp Technology and its application to influenza vaccines.

Uno de los principales desafíos en la producción de proteínas recombinantes es la obtención de proteínas que presenten una conformación estructural idéntica a la conformación nativa. El Molecular Clamp desempeñó un papel muy importante para la obtención de proteínas conformacionalmente estables.   

El laboratorio tiene dos enfoques: uno es el área de vacunas y el otro enfoque es en el área de análisis de estructuras cristalográficas de proteínas y partículas virales. En este laboratorio, resolvimos la estructura cristalográfica de la vacuna contra el SARS-CoV-2 que se estuvo probando en fase clínica 1.

Pero en el laboratorio tenemos varios proyectos. Por ejemplo, contamos con vacunas para el Ébola, Nipah, también para todos los tipos de influenza (influenza A, influenza B).

La vacuna contra la influenza la íbamos a probar en humanos, pero se retrasó debido a la pandemia de la COVID-19. De hecho, cuando yo fui contratado para trabajar aquí en Australia, era para trabajar en el Molecular Clamp que está enfocado en influenza.

Por otro lado, también continúo trabajando en colaboración con el Prof. Alex. Recientemente hemos generado un sistema de genética reversa para construir y manipular los genes virales, del SARS, norovirus, alfa virus, entre otros.

En el laboratorio de Alex se trabaja con ingeniería genética viral y patogénesis, áreas que también forman parte de mi experiencia profesional.

-¿Cuándo iniciaron el proyecto de la vacuna de Queensland?

El proyecto se inició el mismo día en que los investigadores de China publicaron en el banco de datos el genoma del nuevo virus SARS-CoV-2, el cual fue aproximadamente el 12 de enero de 2020. Rápidamente, nosotros mandamos sintetizar el gen de interés y para fines de febrero, ya estábamos con la una fuerte candidata a vacuna.

Desde marzo a junio se obtuvieron todos los datos preclínicos (ensayos en ratones), y en julio, se inició la fase clínica I, la cual terminó aproximadamente a fines de setiembre.

La tecnología Clamp, permite expresar proteínas de fusión de clase I y III. Un ejemplo clásico de este tipo de proteína es la hemaglutinina (HA) encontrados en los virus de la Influenza. El Molecular Clamp no está diseñado para proteínas de fusión de clase II, que serían las proteínas del zika o del dengue.

La tecnología del Molecular Clamp es muy eficiente y versátil, permitiendo la construcción de vacunas en cuestión de meses.

-¿En qué consistió la tecnología de la vacuna de Queensland y que características tiene?

Primero, la vacuna de Queensland presentaba un dominio llamado Molecular Clamp. Ese dominio confiere una alta estabilidad principalmente en preservar su conformación estructural.

Segundo, confiere a la molécula una alta inmunogenicidad (esto es la capacidad que tiene un antígeno de activar el sistema inmunitario e inducir una respuesta inmune).

Tercero, es una vacuna segura, por tratarse apenas de una proteína, no es un microorganismo. Otra característica es su capacidad de termoestabilidad. La vacuna puede fácilmente permanecer estable sin cambios conformacionales a temperaturas hasta 40℃ por varias semanas.

-¿La vacuna es termoestable? ¿Qué significa que sea termoestable?

Quiere decir que la vacuna puede mantenerse a temperaturas de 4 hasta 40℃, sin que los epítopos conformacionales sean afectados hasta 8 semanas, demostrando que no requiere el almacenamiento a temperaturas negativas.

-¿Podrías comentarnos cuáles fueron las fases en la fabricación de la vacuna?

Antes que una vacuna o un medicamento puedan distribuirse en seres humanos, existen unas fases muy rigurosas por las que deben pasar antes:

Fase preclínica, que consiste desde el diseño de la vacuna, las pruebas en células y en animales (ratones y ratas en este caso) y termina con un ensayo in vivo de protección. Con esos resultados, si la vacuna da resultados positivos se pasa a la fase clínica (en humanos) que en general está dividida en tres partes: fase clínica I, II y III.

En el caso de la vacuna de Queensland, la primera fase fue la fase del diseño de la vacuna donde inicialmente fueron diseñadas más de 200 construcciones.

El objetivo era seleccionar una proteína que se exprese bien, que se exprese fácil y que mantenga sus propiedades estructurales muy próxima a la proteína nativa. Ese proceso nos llevó aproximadamente 32 días.

Los criterios principales para seleccionar a la mejor candidata es que tenga características que puedan inducir altos niveles de expresión en las células de mamíferos y también que esta proteína preserve la estructura conformacional nativa.

Seguidamente, realizamos los ensayos de inmunogenicidad en ratones. Cuando nos dimos cuenta que la vacuna tenía la capacidad de inducir anticuerpos específicos contra la proteína spike y que esos anticuerpos eran neutralizantes, comenzaron los ensayos toxicológicos en ratas.

Toda esta fase se denomina preclínica, que incluye el diseño experimental, el diseño de las proteínas que culmina con la selección de la mejor candidata, el ensayo de inmunogenicidad, ensayos toxicológicos, para saber si tiene algún tipo de efecto adverso en ratas.

Al mismo tiempo que comenzaron los ensayos de inmunogenicidad, también comenzaron los ensayos toxicológicos. El último ensayo de la fase preclínica fue el ensayo de protección. Queríamos saber si cuando los ratones inmunizados generaban una protección cuando se les desafía con la cepa virulenta del virus.

En este experimento observamos una reducción significativa de carga viral en el pulmón de los animales testeados y también hubo una reducción en la patología.

Con todo esto termina la fase preclínica: diseño de la vacuna, además de la selección de una candidata ideal que sea capaz de expresar altos niveles de proteínas ya que eso es crítico a la hora de una producción masiva de las dosis.

También, demostramos que la estructura conformacional de la proteína seleccionada sea muy similar a la proteína nativa.

Una vez que se supo que no presentaba ningún efecto adverso, comenzó la optimización del proceso de producción de la vacuna para la fase clínica I. Aquí, una empresa que está asociada a nuestro laboratorio comenzó a optimizar las etapas para la manufactura de las dosis de la vacuna utilizadas en la fase clínica I.

Actualmente, Alberto Amarilla (centro) integra el laboratorio de virología molecular de la Universidad de Queensland, Australia. (Gentileza)

-¿Qué medidas se tomaron para producir una vacuna en tiempo récord como está ocurriendo?

Uno de los principales factores que ayudó a la producción de una candidata a vacuna fueron las capacidades de los integrantes del grupo.

Fueron intensos cuatro meses para obtener todos los resultados preclínicos, mostrando que nuestra candidata a vacuna sería una buena vacuna para ser testada en fase clínica I.

Simultáneamente, un grupo de investigadores se dedicaba a la preparación de toda la parte burocrática, organizando la fase clínica I. Además, existía una industria farmacéutica que estaba asociada al laboratorio, quienes venían optimizando su sistema y cómo producir a gran escala las dosis de la vacuna.

Entonces para el momento que nosotros tuvimos todos los resultados preclínicos, ellos ya tenían todo optimizando el proceso. Cuando nosotros mostramos los resultados, la industria farmacéutica comenzó a producir en los biorreactores (que son estufas enormes para cultivar células y producir de esa forma litros y litros de cultivo celular).

Posteriormente la empresa se encargó de realizar la purificación de las proteínas que se encuentran en el sobrenadante de las células. Hasta tener la proteína ultra pura que finalmente se formulan con los adyuvantes.

En general, los científicos pueden producir todos estos resultados en 6 meses y lo que lleva tiempo son las fases clínicas. Por ejemplo, cada fase lleva más o menos entre 3 a 4 meses. Como son 3 fases, solo las fases clínicas tomarían un año, más los 6 meses que daría los ensayos preclínicos, serían 1 año 6 meses.

Pero como dije, esto solo se consigue porque hay dinero para mover y también se desburocratizó el proceso. Los gobiernos y las autoridades ayudaron mucho en este sentido, sin haber saltado ninguna etapa. Este proceso normalmente lleva de 10 a 20 años, pero sin la burocracia y con dinero todo el proceso puede reducirse.

-¿Cuál fue el motivo por el cual tuvo que ser suspendido el trial de la vacuna de Queensland?

Nuestra tecnología utiliza un dominio de trimerización llamado Molecular Clamp. Este dominio es originado de la proteína GP41 de virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV). Durante la fase clínica 1 fue revelado que los anticuerpos contra el GP41 causan una interferencia con los métodos de diagnósticos utilizados para el HIV, generando falsos positivos.

A pesar de que la vacuna indujo altos niveles de anticuerpos neutralizantes y no presentó ningún efecto secundario, las agencias reguladoras tuvieron que cancelar la fase clínica 2 por causa de su posible interferencia con el diagnóstico del HIV.

-¿Tienen planes de continuar las pruebas de esta vacuna contra la COVID-19? ¿O se enfocarán más en el desarrollo de vacunas contra otras enfermedades?

Actualmente ya contamos con una nueva versión de la vacuna que también induce altos niveles de anticuerpos neutralizantes y no presenta ningún problema de reactividad contra el HIV. Estamos solicitando fondos a diferentes agencias para poder realizar nuevamente la fase clínica 1.2.

-¿Cuál fue tu función dentro del proyecto?

Hace dos años cuando yo me mudé a este laboratorio, me mudé para trabajar con el Molecular Clamp e influenza. En el laboratorio he desarrollado vacunas para varios tipos de influenza, ya que hay varios tipos de influenza como las de pato, las de humano, etc. Realizamos varios estudios con influenzas de diferentes años.

En estos estudios vimos que es necesario siempre estar actualizando la vacuna para influenza que es lo que se realiza actualmente. Ya que la hemaglutinina (H) de la influenza del año pasado no confiere protección contra la influenza que está circulando este año.

Además de esto, tengo experiencia para trabajar con patógenos de nivel de seguridad 3. Microorganismos como West Nile, Rocio, Hantavirus y el SARS-CoV-2, solamente pueden ser manipulados dentro de un laboratorio de nivel de seguridad 3.

Actualmente soy el responsable manager del laboratorio de nivel de bioseguridad 3 (un cargo Ad honorem) de la Universidad de Queensland.

Mi rol dentro del proyecto del desarrollo de la vacuna contra el SARS-CoV-2 fueron los ensayos de neutralización. Este ensayo sirve para informar si los sueros de los ratones inmunizados con nuestra vacuna producían anticuerpos neutralizantes.

Los anticuerpos neutralizantes, son aquellos anticuerpos que bloquean la entrada del virus a la célula. Antes de realizar estos ensayos, primeramente, tuvimos que optimizar un método para evaluar los niveles de neutralización en un tiempo rápido.

Los métodos clásicos llevan entre 4-5 días para obtener los resultados. Con este protocolo, fuimos capaces de reducir el tiempo a menos de 20 horas, además, optimizamos un protocolo para analizar un alto números de muestras en apenas un ensayo.

 

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1 Comentario

  1. Impresionante trabajo, gracias a Dios por personas que se sacrifican invirtiendo horas en investigar. Felicitaciones por los esfuerzos!! Dios permita y el proyecto de Laboratorio de nivel bioseguridad 3 sea posible también en Paraguay
    Dios les ayude con sabiduría y todos los recursos para seguir adelante!!!

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